Hua
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR kete Tirohanga mo te 2019-nCoV
Te whakamahinga e tumanakohia ana
Ka whakamahia tenei kete mo te rapunga kounga o te coronavirus hou (2019-nCoV) ma te whakamahi i te korokoro, te nasopharyngeal swabs, bronchoalveolar lavage fluid, sputum. Ko te hua kitenga o tenei hua mo te tohutoro haumanu anake, a kaua e whakamahia hei taunakitanga anake mo te taatai haumanu me te maimoatanga.
Tikanga tirotiro
Ko te kete kei runga i te hangarau RT-PCR kotahi-taahiraa. Ko te tikanga, ko te 2019 coronavirus hou (2019-nCoV) ORF1ab me nga ira N i tohua hei rohe whakakaha ake. Ko nga tohu tuatahi me nga rangahau karerewharewha (N nga ira ira kua tapaina ki te FAM me nga tirotiro ORF1ab kua tapaina ki te HEX) i hangaia kia kitea te RNA coronavirus momo hou 2019 i roto i nga tauira. Kei roto hoki i te kete he punaha rapunga mana-a-roto (te tirotiro ira ira-a-roto kua tapaina ki te CY5) hei aroturuki i te tukanga o te kohinga tauira, te RNA me te whakakaha PCR, na reira ka whakaiti i nga hua kino teka.
Nga waahanga matua
| Waehanga | Rōrahi（48T/Kete） |
| RT-PCR otinga tauhohenga | 96µl |
| nCOV tuatahi TaqMan probemixture（ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene） | 864µl |
| Mana kino | 1500µl |
| Ngangau pai nCOV(l ORF1ab N Ira) | 1500µl |
Ko nga reagents ake: tangohanga RNA, reagents pure ranei. Te mana kino/pai: Ko te mana pai ko te RNA kei roto te kongakonga whaainga, ko te mana kino ko te wai kore waikawa nucleic. I te wa e whakamahia ana, me whai waahi ki te tangohanga me te whakaaro he hopuhopu. Me whakahaere, ka whakakorehia i runga i nga ture e tika ana.
Ko te ira tohutoro o roto ko te ira RnaseP tangata.
Nga tikanga rokiroki me te ra paunga
-20 ± 5 ℃, karohia te tio tukurua me te whakamaroke neke atu i te 5 nga wa, whai mana mo te 6 marama.
taputapu e tika ana
Me te FAM / HEX / CY5 me etahi atu taputapu PCR rewharewha-maha.
Nga whakaritenga tauira
1. Momo tauira e tika ana: te korokoro, te nasopharyngeal swabs, bronchoalveolar lavage wai, sputum.
2.Kohinga tauira (tikanga aseptik)
Pharyngeal swab: Horoia nga tonsils me te pakitara pharyngeal o muri ki te rua ngopu i te wa kotahi, katahi ka rukuhia te upoko kaukau ki roto i te ngongo whakamatautau kei roto te otinga tauira.
Sputum: I muri i te maremare hohonu o te manawanui, kohia te sputum kua maremare ki roto i te ngongo whakamatautau potae wiri kei roto te otinga tauira; te wai horoi bronchoalveolar: He tauira na nga tohunga hauora. 3.Storage me te kawe i nga tauira
Ko nga tauira mo te wehenga huaketo me te whakamatautau RNA me whakamatau wawe tonu. Ko nga tauira ka kitea i roto i nga haora 24 ka taea te rongoa ki te 4 ℃; te hunga e kore e kitea i roto i te 24
me penapena nga haora ki te -70 ℃ ki raro ranei (mehemea karekau he ahua rokiroki -70 ℃, me noho
ka rongoa mo te wa poto ki te -20 ℃ pouaka pouaka). Ko nga tauira me karo i te tio me te whakamaroke i te wa e kawe ana. Ko nga tauira me tuku wawe ki te taiwhanga i muri i te kohinga. Mena me kawe nga tauira ki tawhiti, ka tūtohuhia te rokiroki tio maroke.
Nga Tikanga Whakamatau
1 Tauira tukatuka me te tangohanga RNA (tauira waahi tukatuka)
E taunaki ana kia tangohia te 200μl o te tauira wai mo te tangohanga RNA. Mo nga mahi tangohanga e pa ana, tirohia nga tohutohu o nga kete tangohanga RNA arumoni. Ko te kino me te kino
Ko nga mana whakahaere o tenei kete i uru ki te tangohanga.
2 PCR takahanga reagent (waahanga reagent preparation)
2.1 Tangohia nga waahanga katoa mai i te kete ka rewa ka uru ki te pāmahana rūma. Centrifuge i te 8,000 rpm mo etahi hēkona i mua i te whakamahinga; tātaihia te nui o ngā reagents e hiahiatia ana, ā, kua whakaritea te pūnaha tauhohenga pēnei i te ripanga e whai ake nei:
| Waehanga | N tohanga (25µl pūnaha) |
| nCOV tuatahi TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| RT-PCR otinga tauhohenga | 2 µl × N |
| *N = te maha o nga tauira i whakamatauria + 1 (mana kino) + 1 (nCOVmana pai) | |
2.2 I muri i te tino ranu i nga waahanga, whakahiatohia mo te wa poto kia taka nga wai katoa i runga i te pakitara ngongo ki raro o te ngongo, katahi ka tukuna atu te 20 µl punaha whakakaha ki roto i te ngongo PCR.
3 Whakatauira (waahi whakarite tauira)
Tāpirihia te 5μl o nga mana kino me te pai i muri i te tangohanga. Ko te RNA o te tauira hei whakamatautau ka taapirihia ki te ngongo tauhohenga PCR.
Kapihia te ngongo me te centrifuge i te 8,000 rpm mo etahi hēkona i mua i te whakawhiti ki te waahi rapunga whakakaha.
4 PCR whakakaha (whakanuia te waahi rapu)
4.1 Whakanohoia te ngongo tauhohenga ki roto i te tauira pūtau o te taputapu, ka whakarite i nga tawhā penei:
| atamira | Porohita tau | Te pāmahana(°C) | Te wa | kohingapae |
| Whakamuriwhakamaoritanga | 1 | 42 | 10 min | - |
| Tuhinga o muan | 1 | 95 | 1min | - |
| Porohita | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | kohinga raraunga |
Kōwhiringa hongere rapu taputapu: Tīpakohia te hongere FAM, HEX, CY5 mo te tohu oro. Mo te tohutoro korikori KORE, kaua e whiriwhiri ROX.
5 Te tātaritanga hua (Tena koa tirohia nga tohutohu whakamatautau o ia taputapu mo te tautuhi)
I muri i te tauhohenga, tiakina nga hua. I muri i te tātaritanga, whakatikahia te uara timatanga, te uara mutunga, me te uara paepae o te raina turanga kia rite ki te ahua (ka taea e te kaiwhakamahi te whakarite kia rite ki te ahuatanga, ka taea te whakarite te uara tiimata ki te 3 ~ 15, ka taea te whakarite i te uara mutunga ki te 5 ~ 20, whakatikatika) i roto i te kauwhata logarithmic I te paepae o te matapihi, ko te raina paepae kei roto i te wahanga o te tohu tohu, ko te raina o te rarangi toraro ranei kei roto i te waahanga o te tohu tohu. i raro i te raina paepae).
6 Te mana nui（Kei roto he mana whakahaere ki te whakamatautau） Mana kino: Karekau he pihi whakakaha e kitea ana mo nga hongere rapu FAM, HEX, CY5
Ko te mana pai o te COV: ko te anau whakakaha kitea o nga hongere rapu FAM me te HEX, Ct value≤32, engari kaore he pihi whakakaha o te hongere CY5;
Ko nga whakaritenga o runga ake me tutuki i te wa kotahi i roto i te whakamatautau kotahi; ki te kore, he muhu te whakamatautau me te whakahoki ano.
7 Te whakatau i nga hua.
7.1 Mena karekau he anau whakakaha, he uara Ct> 40 ranei i roto i nga hongere FAM me HEX o te tauira whakamatautau, a he anau whakakaha kei te hongere CY5, ka taea te whakatau kaore he 2019 coronavirus hou (2019-nCoV) RNA kei roto i te tauira;
.2 Mēnā he ānau whakakaha ake te tauira whakamātautau i roto i ngā hongere FAM me HEX, ā, ko te uara Ct he ≤40, ka taea te whakatau he pai te tauira mo te coronavirus hou 2019 (2019-nCoV).
7.3 Mena he maramara whakahiato te tauira whakamatautau i roto i te hongere kotahi noa o FAM, HEX ranei, a ko te uara Ct he ≤40, a kaore he pihi whakakaha i tera atu hongere, me whakamatau ano nga hua. Mena he rite tonu nga hua whakamatautau, ka taea te whakatau he pai te tauira mo te mea hou
coronavirus 2019 (2019-nCoV). Mena he kino te hua whakamatautau, ka taea te whakatau he kino te tauira mo te coronavirus hou 2019 (2019-nCoV).
Te uara whakatau pai
Ka whakamahia te aratika anau ROC hei whakatau i te uara tohutoro CT o te kete me te uara tohutoro mana o roto he 40.
Te whakamaoritanga o nga hua whakamatautau
1.Me whakamatauhia ia whakamatautau mo nga mana kino me te pai. Ka taea anake te whakatau i nga hua whakamatautau ka tutuki nga mana whakahaere i nga whakaritenga whakahaere kounga
2.I te wa e pai ana te rapu a te FAM me te HEX, ko te hua mai i te awa CY5 (whakahaere mana o roto) ka kino pea na te whakataetae punaha.
3. Ina he kino te hua o te mana whakahaere o roto, mena he kino ano hoki te ngongo whakamatautau FAM me te HEX, ko te tikanga kua monokia te punaha, he he ranei te mahi, t he muhu te whakamatautau. No reira, me whakamatau ano nga tauira.
