Hua
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR kete Tirohanga mo te 2019-nCoV
Te whakamahinga e tumanakohia ana
Ka whakamahia tenei kete mo te rapunga tohu o te coronavirus hou (2019-nCoV) ma te whakamahi i te korokoro korokoro, nasopharyngeal swabs, bronchoalveolar lavage wai, sputum. he taunakitanga mo te taatutanga haumanu me te maimoatanga.Ka tūtohuhia he tātaritanga matawhānui o te mate me nga whakaaturanga haumanu a te manawanui me etahi atu whakamatautau taiwhanga.
Tikanga tirotiro
Ko te kete kei runga i te hangarau RT-PCR kotahi-taahiraa.Ko te tikanga, ko te 2019 coronavirus hou (2019-nCoV) ORF1ab me nga ira N i tohua hei rohe whakakaha ake.Ko nga tohu tuatahi me nga rangahau karerewharewha (N nga ira ira kua tapaina ki te FAM me nga tirotiro ORF1ab kua tapaina ki te HEX) i hangaia kia kitea te RNA coronavirus momo hou 2019 i roto i nga tauira.Kei roto hoki i te kete he punaha rapunga mana-a-roto (te tirotiro ira ira-a-roto kua tapaina ki te CY5) hei aroturuki i te tukanga o te kohinga tauira, te RNA me te whakakaha PCR, na reira ka whakaiti i nga hua kino teka.
Nga waahanga matua
| Waehanga | Rōrahi（48T/Kete） |
| RT-PCR otinga tauhohenga | 96µl |
| nCOV tuatahi TaqMan probemixture（ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene） | 864µl |
| Mana kino | 1500µl |
| Ngangau pai nCOV(l ORF1ab N Ira) | 1500µl |
Ko nga reagents ake: tangohanga RNA, reagents pure ranei.Te mana kino/pai: Ko te mana pai ko te RNA kei roto te kongakonga whaainga, ko te mana kino ko te wai kore waikawa nucleic.I te wa e whakamahia ana, me whai waahi ki te tangohanga me te whakaaro he hopuhopu.Me whakahaere, ka whakakorehia i runga i nga ture e tika ana.
Ko te ira tohutoro o roto ko te ira RnaseP tangata.
Nga tikanga rokiroki me te ra paunga
-20 ± 5 ℃, karohia te tio tukurua me te whakamaroke neke atu i te 5 nga wa, whai mana mo te 6 marama.
taputapu e tika ana
Me te FAM / HEX / CY5 me etahi atu taputapu PCR rewharewha-maha.
Nga whakaritenga tauira
1. Momo tauira e tika ana: te korokoro, te nasopharyngeal swabs, bronchoalveolar lavage wai, sputum.
2.Kohinga tauira (tikanga aseptik)
Pharyngeal swab: Horoia nga tonsils me te pakitara pharyngeal o muri ki te rua ngopu i te wa kotahi, katahi ka rukuhia te upoko kaukau ki roto i te ngongo whakamatautau kei roto te otinga tauira.
Sputum: I muri i te maremare hohonu o te manawanui, kohia te sputum kua maremare ki roto i te ngongo whakamatautau potae wiri kei roto te otinga tauira;te wai horoi bronchoalveolar: He tauira na nga tohunga hauora.3.Storage me te kawe i nga tauira
Ko nga tauira mo te wehenga huaketo me te whakamatautau RNA me whakamatau wawe tonu.Ko nga tauira ka kitea i roto i nga haora 24 ka taea te rongoa ki te 4 ℃;te hunga e kore e kitea i roto i te 24
me penapena nga haora ki te -70 ℃ ki raro ranei (mehemea karekau he ahua rokiroki -70 ℃, me noho
ka rongoa mo te wa poto ki te -20 ℃ pouaka pouaka).Ko nga tauira me karo i te tio me te whakamaroke i te wa e kawe ana.Ko nga tauira me tuku wawe ki te taiwhanga i muri i te kohinga.Mena me kawe nga tauira ki tawhiti, ka tūtohuhia te rokiroki tio maroke.
Nga Tikanga Whakamatau
1 Tauira tukatuka me te tangohanga RNA (tauira waahi tukatuka)
E taunaki ana kia tangohia te 200μl o te tauira wai mo te tangohanga RNA.Mo nga mahi tangohanga e pa ana, tirohia nga tohutohu o nga kete tangohanga RNA arumoni.Ko te kino me te kino
Ko nga mana whakahaere o tenei kete i uru ki te tangohanga.
2 PCR takahanga reagent (waahanga reagent preparation)
2.1 Tangohia nga waahanga katoa mai i te kete ka rewa ka uru ki te pāmahana rūma.Centrifuge i te 8,000 rpm mo etahi hēkona i mua i te whakamahinga;tātaihia te nui o ngā reagents e hiahiatia ana, ā, kua whakaritea te pūnaha tauhohenga pēnei i te ripanga e whai ake nei:
| Waehanga | N te mahi (25µl pūnaha) |
| nCOV tuatahi TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| RT-PCR otinga tauhohenga | 2 µl × N |
| *N = te maha o nga tauira i whakamatauria + 1 (mana kino) + 1 (nCOVmana pai) | |
2.2 I muri i te tino ranu i nga waahanga, whakahiatohia mo te wa poto kia taka nga wai katoa i runga i te pakitara ngongo ki raro o te ngongo, katahi ka tukuna atu te 20 µl punaha whakakaha ki roto i te ngongo PCR.
3 Whakatauira (waahi whakarite tauira)
Tāpirihia te 5μl o nga mana kino me te pai i muri i te tangohanga.Ko te RNA o te tauira hei whakamatautau ka taapirihia ki te ngongo tauhohenga PCR.
Kapihia te ngongo me te centrifuge i te 8,000 rpm mo etahi hēkona i mua i te whakawhiti ki te waahi rapunga whakakaha.
4 PCR whakakaha (whakanuia te waahi rapu)
4.1 Whakanohoia te ngongo tauhohenga ki roto i te tauira pūtau o te taputapu, ka whakarite i nga tawhā penei:
| atamira | Porohita tau | Te pāmahana(°C) | Te wa | kohingapae |
| Whakamuriwhakamaoritanga | 1 | 42 | 10 min | - |
| Tuhinga o muan | 1 | 95 | 1min | - |
| Porohita | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | kohinga raraunga |
Kōwhiringa hongere rapu taputapu: Tīpakohia te hongere FAM, HEX, CY5 mo te tohu oro.Mo te tohutoro korikori KORE, kaua e whiriwhiri ROX.
5 Te tātaritanga hua (Tena koa tirohia nga tohutohu whakamatautau o ia taputapu mo te tautuhi)
I muri i te tauhohenga, tiakina nga hua.I muri i te tātaritanga, whakatikahia te uara timatanga, te uara mutunga, me te uara paepae o te rarangi turanga kia rite ki te ahua (ka taea e te kaiwhakamahi te whakarite kia rite ki te ahuatanga tuuturu, ka taea te whakarite te uara tiimata ki te 3 ~ 15, ka taea te whakarite te uara mutunga ki 5~20, whakatikatika) i roto i te kauwhata taurangi I te paepae o te matapihi, ko te raina paepae kei roto i te waahanga taurangi, a, ko te pihinga whakanui o te mana kino he raina tika, kei raro ranei i te raina paepae).
6 Te mana nui（Kei roto he mana whakahaere ki te whakamatautau） Mana kino: Karekau he pihi whakakaha e kitea ana mo nga hongere rapu FAM, HEX, CY5
Ko te mana pai o te COV: ko te anau whakakaha kitea o nga hongere rapu FAM me te HEX, Ct value≤32, engari kaore he pihi whakakaha o te hongere CY5;
Ko nga whakaritenga o runga ake me tutuki i te wa kotahi i roto i te whakamatautau kotahi;ki te kore, he muhu te whakamatautau me te whakahoki ano.
7 Te whakatau i nga hua.
7.1 Mena karekau he anau whakakaha, he uara Ct> 40 kei roto i nga hongere FAM me te HEX o te tauira whakamatautau, a he anau whakakaha kei te hongere CY5, ka taea te whakatau kaore he coronavirus hou 2019 (2019-nCoV) RNA i roto i te tauira;
.2 Mēnā he ānau whakakaha ake te tauira whakamātautau i roto i ngā hongere FAM me HEX, ā, ko te uara Ct he ≤40, ka taea te whakatau he pai te tauira mo te coronavirus hou 2019 (2019-nCoV).
7.3 Mena he maramara whakahiato te tauira whakamatautau i roto i te hongere kotahi noa o FAM, HEX ranei, a ko te uara Ct he ≤40, a kaore he pihi whakakaha i tera atu hongere, me whakamatau ano nga hua.Mena he rite tonu nga hua whakamatautau, ka taea te whakatau he pai te tauira mo te mea hou
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Mena he kino te hua whakamatautau, ka taea te whakatau he kino te tauira mo te coronavirus hou 2019 (2019-nCoV).
Te uara whakatau pai
Ka whakamahia te aratika anau ROC hei whakatau i te uara tohutoro CT o te kete me te uara tohutoro mana o roto he 40.
Te whakamaoritanga o nga hua whakamatautau
1.Me whakamatauhia ia whakamatautau mo nga mana kino me te pai.Ka taea anake te whakatau i nga hua whakamatautau ka tutuki nga mana whakahaere i nga whakaritenga whakahaere kounga
2.I te wa e pai ana te rapu a te FAM me te HEX, ko te hua mai i te awa CY5 (whakahaere mana o roto) ka kino pea na te whakataetae punaha.
3. Ina he kino te hua o te mana whakahaere o roto, mena he kino ano hoki te ngongo whakamatautau FAM me te HEX, ko te tikanga kua monokia te punaha, he he ranei te mahi, t he muhu te whakamatautau.No reira, me whakamatau ano nga tauira.
